Введение
Нанотехнологии открывают несколько новых возможностей для воздействия на живые системы. Одной из таких возможностей является точная адресная доставка биологически-активных веществ внутрь клетки. Митотехнология — это метод, позволяющий доставлять требуемые вещества в клетку с точностью до нескольких нанометров — во внутреннюю мембрану митохондрий. Метод позволяет конструировать лекарственные препараты на основе липофильных катионов. Разработка таких препаратов, а также исследование их физико-химических свойств и биологической активности имеют ряд уникальных особенностей.
Запрограммированное старение
Существует множество гипотез старения. Наиболее распространенной и убедительной из них считается свободно-радикальная концепция Д. Хармана, предположившего, что ведущую роль в ослаблении жизненных функций с возрастом играет окисление биополимеров активными формами кислорода (АФК).
В нашей стране это направление развивал замечательный российский биохимик Эмануэль Н.М. В соответствии с этой гипотезой было установлено, что при старении возрастает уровень окисленности ДНК, белков и липидов. Подобная ситуация может быть следствием увеличения в старости продукции АФК или ослаблении антиооксидантной защиты, либо просто длительности повреждающего воздействия АФК, пропорционального возрасту организма.
Одним из крупнейших открытий последних десятилетий стало обнаружение "программ клеточной смерти". Было установлено, что гибель клетки происходит, как правило, в результате включения одной из таких программ (апоптоза или некроза), заложенных в ее геноме.
Это открытие послужило основанием для заключения, что, по крайней мере, одноклеточные организмы располагают механизмом самоликвидации. Было показано, что "программы смерти" существуют у бактерий и одноклеточных эукариот, таких как, например, дрожжи. Описано множество примеров, доказывающих, что запрограммированная смерть особи процесс, названный академиком В.П. Скулачевым "феноптозом" (слово придумано нашим знаменитым лингвистом академиком М.Л. Гаспаровым), присущ также и высшим организмам - животным и растениям, хотя его молекулярные механизмы еще только предстоит выяснить. Биологический смысл феноптоза достаточно очевиден по аналогии с апоптозом - очищение популяции от нежелательных особей с целью защиты всей популяции, в случае если они, эти особи, несут для нее угрозу. Другой функцией феноптоза могли бы быть ускорение смены поколений и стимуляция этим и другими способами биологической эволюции организмов.
Концепция феноптоза заставляет по-другому взглянуть на проблему старения. Что если это тот способ, которым природа заставляет нас уходить, освобождая место молодым? Что если это медленное угасание, также как и программа апоптоза, заложено в виде генетической программы в нашем геноме и его основным биологическим смыслом является ускорение эволюции? Эти вопросы позволили В.П. Скулачеву сформулировать теорию запрограммированного старения, как инструмента эволюции.
Причины старения
Теория старения как медленного феноптоза дает нам шанс. Если существует программа, медленно, но верно, ведущая нас к смерти, то, возможно, в нее можно вмешаться, перенастроить ее, замедлить и даже вовсе сломать. К сожалению, на данном этапе развития биоинженерия еще не вполне созрела для создания новых биологических систем, биохимических путей и т.п. Но ломать всегда проще, чем строить.
Сейчас наука располагает мощнейшим арсеналом средств, позволяющих останавливать реализацию самых разных генетических программ.
Речь не идет об изменении генома – сегодня человек еще не готов к вмешательству в собственные гены. Биология не может предсказать все последствия такого шага, который может стать необратимым для организма. Остается фармакологический подход – поиск вещества, способного не столько изменить саму программу старения, сколько помешать ее реализации, действуя на определенную мишень ‑ какой-то элемент, процесс в клетке или организме, принципиально важный для работы вредоносной программы. Где искать эту мишень?
Здесь необходимо вернуться к гипотезе Д. Хармана. Безусловно, активные формы кислорода (АФК) ‑ подходящие кандидаты на роль «самурайского меча», используемого организмом, решившим совершить биохимическое самоубийство. Даже если они и не являются главной, непосредственной причиной старения, то, безусловно, принимают непосредственное участие в этом процессе. В клетке существует множество различных АФК, которые выполняют самые разные (и не всегда – вредные) функции. Где же искать те, что участвуют в процессах старения? Есть целый набор ферментов, превращающих О2 в первичную форму АФК – радикал супероксида (О2·-) или в его производное – перекись водорода. Однако все они по мощности значительно уступают дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий. За день митохондрии взрослого человека поглощают около 400 л О2, превращая его в воду путем четырехэлектронного восстановления. Однако, если хотя бы 0,1% этого количества О2 будет восстановлено химически более простым, одноэлектронным образом, то получится 0,4 л О2·-, что намного превышает возможности всех прочих механизмов генерации АФК, вместе взятых.
Фактически мы носим в своих митохондриях потенциальный генератор сильнейшего яда, который легко может убить наши клетки и нас самих вместе с ними.
Такая катастрофа произойдет даже не из-за прямого токсического действия АФК, а вследствие запуска процессов апоптоза или некроза, мощными индукторами которых служат АФК.
Следовательно, митохондриальные АФК являются привлекательным кандидатом на роль «мишени», поразив которую можно было бы отменить биохимический механизм самоубийства.
Классификация антиоксидантов
Наиболее известные антиоксиданты: аскорбиновая кислота (витамин С), токоферол (витамин Е), ß-каротин(провитамин А) и ликопин (в томатах). К ним также относят полифенолы: флавин и флавоноиды (часто встречаются в овощах), танины (в какао, кофе, чае), антоцианы (в красных ягодах).
Антиоксиданты делятся на два больших подкласса в зависимости от того, являются ли они растворимыми в воде (гидрофильные) или в липидах (липофильный). В общем, водорастворимые антиоксиданты окисляются в цитозоле клетки и плазме крови, в то время как липидорастворимые антиоксиданты защищают клеточные мембраны от перекисного окисления липидов. Антиоксиданты могут быть синтезированы в организме или поступать из рациона. Различные антиоксиданты присутствуют в широком диапазоне концентраций в жидкостях и тканях организма, при этом некоторые (глутатион или убихинон) в основном присутствуют внутри клеток, тогда как другие (мочевая кислота) распределены более равномерно. Некоторые антиоксиданты можно найти только в отдельных организмах, эти соединения могут иметь важное значение в патогенезе и факторах вирулентности микроорганизмов.
Ионы Скулачова
На рубеже 1960- 70-х гг. В.П. Скулачев и его коллеги в МГУ совместно с группой профессора Е.М. Либермана в Академии Наук СССР были заняты проверкой справедливости хемиосмотической гипотезы П. Митчелла (Нобелевская премия по химии за 1978 г.), постулировавшего наличие разности электрических потенциалов на мембране митохондрий. Результаты этой работы, опубликованные в журнале Nature (222, 1076-8), показали, что некоторые соединения - липофильные катионы (например, ионы фосфония), способны адресно проникать в митохондрии, движимые электрическим полем на митохондриальной мембране (знак "минус" внутри митохондрии). В 1974 г. такие соединения были названы известным американским биохимиком Д. Грином "ионами Скулачева".
В начале 70-х гг. В.П. Скулачев, профессор Л.С. Ягужинский и академик С.Е. Северин высказали предположение, что проникающие катионы могут использоваться митохондрией как "молекулы-электровозы" для накопления в них незаряженных веществ, присоединенных к этим катионам.
В конце 90-х гг. британский биохимик М.П. Мерфи использовал этот подход, попытавшись создать митоходриально-адресованный антиоксидант. Он присоединил к липофильному иону трифенилалкилфосфония витамин Е. К сожалению, это вещество, равно как и его несколько более удачный вариант, в котором использован убихинон вместо витамина Е, до сих пор не нашли применения на практике, видимо, из-за сильного прооксидантного действия и недостаточной эффективности в низких дозах. Перспективность всего подхода оказалась под сомнением.
Однако, в 2003 г. группа академика В.П. Скулачева начала разработку нового митоходриально-адресованного антиоксиданта. Чтобы принципиально повысить его эффективность был использован пластохинон — вещество из самого насыщенного кислородом места в живой природе — хлоропластов растений. Было сконструировано и синтезировано вещество SkQ1, эффективность которого оказалась выше предыдущих аналогов в сотни раз.
SQK
SkQ — класс митохондриально-направленных антиоксидантов, разработанных под руководством академика Владимира Скулачёва.
В широком смысле SkQ-вещество представляет собой липофильный катион, соединенный через насыщенный углеводородный фрагмент с антиоксидантом. Благодаря липофильности SkQ эффективно проникает через мембраны клетки. При этом положительный заряд обеспечивает направленную доставку присоединенного антиоксиданта в отрицательно заряженный матрикс митохондрий. Концепция запатентована как в России, так и в Америке.
Иногда термин SkQ применяется в узком смысле для обозначения катионного производного растительного антиоксиданта пластохинона.
Липофильность (буквально — сродство к жирам) — свойство вещества, означающее его химическое сродство к органическим веществам, является по сути синонимом гидрофобности. Величина, которая определяется экспериментально, а также может быть рассчитана при помощи таблицы инкрементов групп атомов для органических соединений.
Положительный эффект действия SkQ объясняется его характерными свойствами:
1. проникновение в митохондрии — главный источник активных форм кислорода (АФК) клетки,
2. ингибирование АФК на месте их образования, причем двумя разными способами:
· прямо гашение АФК за счет окисления пластохинона,
· снижние потенциала мембраны митохондрий.
Благодаря своей липофильности SkQ-вещества способны проникать через липидный бислой. Движение происходит по электрическому потенциалу за счет наличия положительного заряда. Митохондрии клетки — единственный внутриклеточный компартмент с отрицательным зарядом. Поэтому SkQ эффективно проникает и накапливается именно в них.
Коэффициент накопления может быть оценен из уравнения Нернста. Для этого нужно учесть, что потенциал плазматической мембраны клетки составляет около 60 mV (цитоплазма имеет отрицательный заряд), а потенциал мембраны митохондрий — около 180 mV (матрикс имеет отрицательный заряд). В результате электрический градиент SkQ между внеклеточной средой и матриксом митохондрий составляет 104.
Также нужно учитывать, что SkQ обладает высоким коэффициентом распределения между липидом и водой, порядка 104. С его учетом суммарный концентрационный градиент SkQ составит 108.
Прооксидантное действие
При больших концентрациях (микромоль и более) SkQ-соединения проявляют свойства прооксиданта — провоцируют выработку АФК.
Достоинство SkQ1 состоит в том, что разница в концентрациях между про- и антиоксидантной активностью составляет 1000. Эксперименты на митохондриях показали, что SkQ1 начинает проявлять свойства антиоксиданта уже при концентрациях 1 nM, а прооксидантную — при концентрациях около 1 μM. Для сравнения, концентрацию MitoQ достаточно увеличить до 0.5 μM — менее, чем в два раза, чтобы соединение стало увеличивать продукцию АФК митохондриями. Появляение антиоксидантной активности MitoQ начинается только с концентраций 0.3 μM.
Заживление ран
Результаты получены группами Ю.М.Васильева, И.Ю.Сахарова
Как показали предыдущие эксперименты, SkQ способен смягчить окислительный стресс, в котором находятся клетки в культуре. Это позволяет фибробластам человека при искусственном культивировании перейти в более «нормальное» состояние, проявляющееся, в частности, в более прочном закреплении на подложке и увеличении размеров.
Кроме того, было отмечено появление в фибробластах гладкомышечного актина, а также усиление синтеза клеточного фибронектина. Все эти признаки характерны для специализированной формы фибробластов – миофибробластов, которые активно участвуют в заживлении ран. Полученные результаты позволили предположить, что SkQ1 может стимулировать заживление ран. Для проверки этого предположения был поставлен простой модельный эксперимент на монослое фибробластов – сплошном слое клеток, покрывающем чашку Петри.
Этот слой был разрезан с помощью скальпеля. Далее измерялась скорость зарастания образовавшейся «раны» в присутствии SkQ1 и в контрольной чашке. Оказалось, что SkQ1 существенно ускоряет этот процесс.
Данный результат открыл целое направление в Проекте – разработку продукта для ускорения заживления ран и ожогов.
Эта проблема особенно актуальна для людей старшего возраста, а также страдающих некоторыми системными заболеваниями (например, диабетом). В качестве лекарственной формы для заживления ран было решено разработать полимерные раневые покрытия – самый современный способ доставки биологически активных веществ в раны.
Предварительные результаты применения этих пленок на животных оказались положительными – пленки с определенной дозировкой SkQ1 действительно ускоряют заживление ран у лабораторных крыс.
Список используемой литературы:
1. Северин С.Е., Скулачев В.П., Ягужинский Л.С. Возможная роль карнитина в транспорте жирных кислот через митохондриальную мембрану // Биохимия. — 1970. — № 35. —С. 1250–1252.
2. David E. Green (1974). «The electromechanical model for energy coupling in mitochondria.». Biochimica et Biophysica Acta (346): 27-78.
3. Gruber J, et al (2012). «Mitochondria-targeted antioxidants and metabolic modulators as pharmacological interventions to slow ageing». Biotechnol Adv
4.Antonenko YN, Roginsky VA, Pashkovskaya AA, Rokitskaya TI, Kotova EA, Zaspa AA, et al. (2008). «Protective effects of mitochondria-targeted antioxidant SkQ in aqueous and lipid membrane environments.». J Membr Biol (222): 141–9
5.http://www.skq-project.ru/doc/index.php?ID=45
6.http://www.skq-project.ru/doc/view.php?ID=91
7.http://www.skq-project.ru/doc/view.php?ID=92
8.http://www.skq-project.ru/doc/index.php?ID=46
9.http://www.skq-project.ru/doc/index.php?ID=49
10.http://www.skq-project.ru/doc/index.php?ID=50
| 
